La chiesa è suddivisa in tre navate da una fuga di classicheggianti colonne con scanalature, capitello corinzio e basamento rialzato a causa del successivo abbassamento del pavimento. L'altare maggiore conserva la reliquia della Santa Croce di Cristo, rinvenuta aul luogo del Calvario dall'imperatrice Sant'Elena nel 327. Molto ampi sono il presbiterio e l'abside, ove, sul fondo, in gloria è collocato il simbolo della Santa Croce. In tutto lo spazio del presbiterio e del coro, fino al 1971, nei giorni di Carnevale, durante la pia pratica delle Quarant'ore con l'esposizione e l'adorazione della Santissima Eucarestia, veniva allestita una originalissima rappresentazione denominata "Teatro Sacro". A capo della navata di destra c'è la cappella del Santissimo Sacramento, consacrata nel 1917, tutta dipinta da Giuseppe, Alessandro e Maria Pia Catani. Si tratta di dipinti su tela applicata poi alle pareti della Cappella. Vi sono rappresentate la chiesa "militante" e quella "trionfante".In testa alla navata di sinistra, a "cornu Evangelii" sta invece la cappella della Beata Vergine del Soccorso, opera del pitore Silvio Galimberti di Roma, consacrata nel 1922.

Oggi in questa cappella è venerata la sacra immagine della Madonna di Pompei. Altre cappelle sono disposte lungo le pareti perimetrali della chiesa. Nella navata destra, vicino all'ingresso, è stato collocato il busto (con epigrafe e stemma) del cardinale Francesco Cherubini (1585-1656), vescovo di Senigallia, sepolto nella demolita chiesa delle "Quattro Colonne". Avanzando si trova il dipinto raffigurante San Giovanni Bosco, opera del pittore ostrense T.Bedini (1929-1961). Nella cappella successiva c'è una tela raffigurante la Madonna con Bambino in gloria e i Santi Caterina da Siena e Vincenzo Ferreri. Più avanti in una nicchia è collocata la statua di San Vincenzo Ferreri, con la scritta sul libro aperto "Timete Deum ed date illi honorem" (temete Dio e rendeteGli onore). Segue la cappella di San Carlo Borromeo con una tela dell'anconetano Menghini (1964), rappresentante la Madonna con Bambino in gloria, i Santi Carlo Borromeo e Nicola di Bari e, sullo sfondo, la città di Ostra. Nella navata sinistra, subito dopo la cappella della Madonna di Pompei, troviamo quella del Sacro Cuore di Gesù, seguita dal piccolo sacello ove si venerano i santi locali San Gaudenzio, Santa Maria Goretti e il Beato Pio IX. Nella nicchia soprastante è collocata la statua di Sant'Isidoro. Procedendo verso l'uscita si incontra l'altare della "prodigiosissima" immagine di Maria SS. Addolorata, dipinta su lastra di rame: è questa una della otto sacre immagini venerate in Ostra che hanno operato il miracolo del movimento degli occhi nel 1796. In fondo è giustamente collocato il Fonte Battesimale, opera dello scultore anconetano Vittorio Morelli (1927).